嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法是一种新型的过继免疫细胞疗法，其通过对病人T细胞的工程化改造，将独立的MHC特异性抗原受体与协同刺激分子融合在T细胞内外，跳过抗原处理和呈递过程，直接激活T细胞对癌症特异性抗原的免疫应答。

       CARs由细胞外、跨膜和细胞内域三部分组成。细胞外域由一个单链可变片段（scFv）组成，它来自于抗体的轻和重链区域，作用是在不涉及MHC的情况下，与特定肿瘤相关抗原（TAA）结合。跨膜域也称为铰链域，由CD8和IgG4分子组成。它是细胞外和细胞内域之间的连接纽带。胞内域也被称为激活或信号域，由CD3ζ组成。在细胞内信号域的基础上，CAR受体有4代。CD3ζ是第一代的细胞内域。在接下来的几代中，为了增强T细胞的激活、增殖和持久性，添加了共同刺激分子如，CD27、CD28、4-1BB或OX-40。第二代由一种共刺激分子组成，第三代由两个共刺激分子组成。除了CD3ζ和共刺激分子，第四代还增加了抗肿瘤细胞因子基因（IL-12，IL-15），增强了工程化T细胞的抗肿瘤效应。

       四代CAR-T原理图

       目前，CAR-T疗法在血液恶性肿瘤中表现出了良好的效果，但却无法证明其在实体瘤中的价值。失败的原因有三，分别是：①缺乏合适的针对实体瘤的表面抗原；②肿瘤免疫逃逸机制影响CAR-T细胞在实体瘤中的浸润；③免疫抑制的肿瘤微环境降低了CAR-T细胞的功效。在此，我们将讨论采取哪些策略来增强CAR-T细胞疗法在实体瘤中的应用。

       如何解决缺乏合适针对实体瘤的表面抗原的问题

       策略1：靶向肿瘤突变抗原

       EGFR是ErbB致癌基因家族成员之一，也表达在正常和肿瘤细胞表面。在许多癌症，如胰 腺 癌、头颈癌、结肠癌和乳腺癌中，EGFR均过表达，适合作为CAR-T细胞疗法的靶点。研究发现，敲出EGFR的6-273氨基酸形成的EGFRvIII，在脑癌中高表达，也是一种理想的靶点。类似地，另一个针对脑癌的靶点是IL13Rα2。它是仅仅表达于癌细胞，正常脑组织中不表达。在胶质母细胞瘤中过度表达，关于IL13Rα2的T细胞治疗正在进行中。

       策略2：靶向多个肿瘤抗原

       EGFRvIII CAR-T细胞疗法在胶质瘤病人表现出区域差异。IL13Rα2 CAR-T细胞疗法在治疗初期有应答反应，但随后由于对CAR-T的免疫抑制癌细胞又重新出现。为了解决这一问题，研究使用针对双靶点（EphA2 HER2 和IL13Rα2）的CAR-T细胞疗法表现出了良好的预临床效果。

       策略3：对CAR-T细胞进行再修饰

       从1代发展到4代，研究者一直在对CAR-T细胞近行不断修饰和改进。有一些T细胞激活的负调节蛋白如二酰基甘油(DAG)激酶，它有助于第二信使DAG的代谢和降解，来限制RAS的激活。针对这些调节剂和制造没有这些酶的CAR-T细胞，可以提高T细胞治疗在实体肿瘤中的功效。

       策略4：筛选肿瘤过表达抗原

       实体瘤的异质性是CAR-T细胞疗法在实体瘤中关键的限制因素。治疗过程中，细胞表面抗原异质性是肿瘤复发的主要原因之一。筛选出肿瘤表面抗原过表达的病人是解决这一问题的途径之一。针对高抗原表达的患者采用特定的CAR-T细胞进行治疗，可以减少肿瘤局部反应的机会，提高整体疗效。

       策略5：双CAR系统

       CAR-T细胞疗法的一个主要问题是找到理想的抗原，因为大多数抗原也由正常的身体细胞表达。因此，激活的T细胞，也会破坏正常的组织。为了避免这种复杂性，引入了双CAR的新概念。即工程化的T细胞包含两种CAR-T细胞，T细胞的激活将取决于这两中CAR-T细胞同时与它们的特定抗原结合。它将增加T细胞对肿瘤细胞的特异性，而正常组织则会减少与免疫相关的损害。最初，这些双CAR-T细胞甚至在呈现一种抗原时也表现出了溶解细胞反应，因为激活是如此强烈，以至于一种抗原能够引发免疫反应。后来，研究人员降低了CAR-T的亲和力，需要与CAR-T细胞结合的双肿瘤抗原来启动免疫应答。有了这个策略，我们就能控制免疫反应的亲和力，也能预防免疫相关的不良反应。双CAR系统FT819预临床数据在2018年AACR上大放异彩。

       策略6：引入自杀基因

       在正常组织中也存在目标抗原的情况下，抗肿瘤的效果就与免疫相关的毒性有关了，因为我们不希望正常的细胞受到伤害。这种毒性可以通过诱导自杀基因来预防。这些自杀基因会选择性地抑制CAR-T细胞，从而减少对邻近正常组织的伤害。目前在血液恶性肿瘤中有两种自杀基因，它们是诱导型caspase 9和单纯性疱疹胸苷激酶。这一策略将提高汽车T细胞治疗的疗效和临床反应。

       如何解决肿瘤免疫逃逸机制对CAR-T细胞在实体瘤中浸润的影响

       策略1：使CAR-T细胞上表达趋化因子受体

       趋化因子由癌细胞分泌，有助于T细胞的移行至肿瘤部位。对于CAR-T细胞适当的迁移，CAR-T细胞受体应该是对趋化因子的补充。如果受体和趋化因子间存在不匹配，也会出现次优的细胞输送，从而导致临床反应不佳。因此，添加这些趋化因子基因将更好地迁移T细胞，改善临床反应。

       策略2：利用溶瘤病毒提高趋化因子对CAR-T细胞的输送

       在不影响正常细胞的情况下，溶瘤病毒有选择性地感染、复制和导致恶性细胞的溶解。因此，溶瘤病毒装备CCL5（也称为RANTES）和IL-15后，将起到趋化因子和生长因子的作用，有助于T细胞的迁移，并为T细胞的生长和生存创造一个细胞因子丰富的环境。与动物研究中的个别疗法相比，武装的溶瘤病毒和T细胞疗法联合使用，显示出了显著的效果。因此，研究人员将这两种特性结合起来，以改善CAR-T细胞的输送。另一个好处是，这些趋化因子仅在肿瘤细胞附近被检测到，而不是在血清中，因此没有系统性毒性。

       策略3：HPSE-CAR-T细胞

       T细胞会降解细胞外基质（ECM）和亚内皮基底膜，促进对肿瘤细胞的渗透。它们分泌特定的酶来实现这个功能，其中一个是乙酰肝素酶（HPSE），它能裂解HSPGs的硫酸乙酰肝素链。在CAR-T细胞工程化时，功能上的变化使它们无法分泌HPSE，从而减少了CAR-T细胞治疗的抗肿瘤效果。为了解决这个问题，研究人员开发了能够表达HPSE的工程T细胞。HPSE的CAR-T细胞疗法显示了更好的ECM降解效果，增强了T细胞的渗透，提高了抗癌效果。这一策略对改善实体肿瘤中T细胞治疗的效果是有益的。

       策略4：CAR-T细胞的区域递送

       对CAR-T疗法的主要担忧是系统的副作用，以及CAR-T细胞在癌症部位的不良递送。如果我们能直接在肿瘤部位运送T细胞，这些都可以得到处理。目前，对CAR-T细胞的区域传递进行了各种临床前和临床研究，已经得到了不多的结果。

       改善肿瘤微环境提高CAR-T功能策略

       策略1：PKA抑制CAR-T细胞疗法

       PGE2是一种免疫抑制因子，它在肿瘤细胞上表达，通过抑制T细胞增殖和CD4辅助性T细胞功能来抑制免疫反应。PGE2与腺苷一起激活PKA，进一步抑制T细胞增殖。RIAD是一种肽，可以破坏PKA和埃兹蛋白之间的联系，解除PKA对T细胞激活的抑制。CAR-T-RIAD细胞疗法直接针对间皮素，提高了CAR-T细胞浸润，细胞因子释放，和抗肿瘤效果。

       策略2：过氧化氢酶CAR-T细胞疗法

       在实体瘤中，肿瘤微环境的炎症反应增加了ROS的产量，高剂量的ROS通过抑制免疫反应来帮助肿瘤生长和增殖。为了提高高氧化肿瘤微环境中CAR-T细胞的持久性，研究人员已经引进了表达过氧化氢酶的CAR-T细胞，减少肿瘤环境中氧化应激反应，为CAR-T细胞免受氧化损伤提供了保护，增强了抗肿瘤的效果。与此同时，它还为邻近的NK细胞提供了保护，进一步有助于降解癌细胞。

       策略3：IDO抑制CAR-T细胞疗法

       缺乏营养是实体瘤中CAR-T细胞治疗失败的一个主要原因。色氨酸是一种必需的氨基酸，由IDO代谢成免疫抑制代谢物，如3羟基蒽酸（3-HAA）和Kynurenine。在芳基烃受体（AHR）的帮助下，这种代谢物抑制T细胞增殖并导致T细胞的裂解。在淋巴瘤的体内研究中，在CD19-CAR-T治疗之前，给予氟达拉宾和环磷酰胺减少了IDO的表达，增强了抗肿瘤的效果。

       策略4：抗纤维化细胞激活蛋白（FAP）CAR-T细胞疗法

       与癌症相关的基质细胞（CASC）是癌症周围的正常基质细胞。它们分泌各种细胞因子、生长因子、趋化因子，帮助肿瘤扩散和转移。FAP是一种丝氨酸蛋白酶，它在上皮癌CASC中高度表达，并促进肿瘤发生。因此，CAR-T细胞疗法被设计成针对FAP。已经在动物实验中，促进CAR-T细胞效能方面取得了优异的成绩，在实体瘤中是一种有用的工具。

       除此之外，其它的改善肿瘤微环境提高CAR-T功能策略包括CD40配体的CAR-T细胞、肿瘤生长因子β（TGFβ)负转基因CAR-T细胞、靶向细胞因子的CAR-T细胞和ICIs CAR-T细胞疗法等。CD40L同它的受体CD40结合，致使树突状细胞抗原呈递，细胞因子释放，免疫球蛋白的同型转换，激活B细胞。ICIs能改善肿瘤的微环境，解除肿瘤细胞对免疫细胞的免疫抑制。靶向细胞因子主要是解除某些细胞因子如IL-4和IL10的免疫抑制作用。这些新型CAR-T细胞疗法在预临床中均表现除了很好的疗效。

       参考文献：

       1. Jindal V, Arora E, Gupta S. Medical Oncology, 2018, 35(6): 87.

       2. Wei G, Ding L, Wang J, et al. Experimental hematology & oncology, 2017, 6(1): 10.

       作者简介：Tumour,食品科学与工程专业学士，国家三级公共营养师，生物化工专业硕士，目前为医药行业从业者，致力于癌症靶点及IRs抗体的研究开发，工作之余时刻关注医药行业动态和进展，同时从健康安全角度热切关注食品行业动态，为人类健康传播和提供科学的食品知识。