这两项研究表明，长久以来流行的抗CTLA-4抗体Ipilimumab在癌症免疫治疗中的免疫检查点假说并不成立，即Ipilimumab并没有通过阻断CTLA-4/B7相互作用而发挥抗肿瘤效果，而清除Fc受体介导的高表达CTLA-4的肿瘤局部调节性T细胞（Treg）则在有效的免疫治疗中至关重要。作者利用CTLA-4人源化的新生小鼠模型，模拟临床上Ipilimumab单用以及联用造成的各个脏器的免疫副作用，并评估了其它抗CTLA-4抗体的安全性，阐明了失调的自身反应性Treg及全身T细胞的活化是造成免疫副作用的根本原因。这些研究成果对今后研发新一代高效并且安全的抗CTLA-4抗体以及其它以CTLA-4为靶点的药物有着深远的指导意义。

       近年来，随着肿瘤免疫调控机制的逐渐清晰和基因改造技术的不断提高，肿瘤免疫治疗领域得到了空前发展。尤其是近几年来，免疫检查点 （Immune Checkpoint）单抗药物与嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞免疫治疗的效果逐渐获得认可，癌症免疫治疗的概念也越来越深入人心。目前肿瘤免疫药物治疗的最主要方面是肿瘤免疫检查点抑制剂，即通过抑制肿瘤细胞的免疫逃逸，调动自身免疫系统功能来消除肿瘤，当前的研究主要集中在CTLA-4、PD-1和PD-L1三个分子上。

       CTLA-4分子高表达于调节性T淋巴细胞（Treg）和激活的T淋巴细胞上。正常情况下，T淋巴细胞的活化需要两条信号通路共同激活，其一是T细胞受体（TCR）与抗原呈递细胞（APC）呈递的MHC-抗原肽复合物相结合（信号1），其二是B7分子（B7-1或B7-2）与T细胞表面的共刺激分子CD28相结合（信号2）。T细胞活化后高表达的CTLA-4分子虽然与CD28具有高度同源性，但功能相反，即CTLA-4分子与B7分子结合后抑制T细胞的活化。

       2011年，美国FDA批准首款抗CTLA-4抗体抑制剂Ipilimumab（商品名YERVOY?）用于黑色素瘤的治疗，疗效显著。根据免疫检查点阻断的假说（Checkpoint Blockade Hypothesis），在外周淋巴器官，抗CTLA-4抗体如Ipilimumab是主要通过阻断抑制性的CTLA-4/B7信号通路【图1】，从而促进T细胞的激活而发挥抗肿瘤作用。然而这一流行的关于Ipilimumab在癌症免疫治疗中发挥作用的主要假说并没有得到严格的实验验证。

       图1. T细胞的活化需要通过TCR/MHC（信号1）和CD28/B7（信号2）进行共刺激。 抗原呈递细胞（APC）上的B7分子（包括B7-1和B7-2）与T细胞上的CTLA-4的结合抑制T细胞功能。 抗CTLA-4抗体阻断CTLA-4结合B7并阻止其对T细胞功能的抑制。

       虽然Ipilimumab可以阻断锚定状态的（Immobilized ）CTLA-4分子和游离的（Soluble ）B7分子的相互作用【图2A】（J Immunol. 2003 Dec 1;171(11):6251-9.），但B7分子是膜表面表达的共刺激分子，因此以前的研究并不能证实Ipilimumab能够有效阻断在生理状态下的CTLA-4和B7的相互作用。刘阳/郑盼教授联合实验室的研究表明，当B7分子被固定后（比如B7包被在ELISA板上时【图2B】或者表达在细胞表面【图2C】），Ipilimumab（包括临床上使用的Ipilimumab以及按照已公布的抗体序列由不同公司合成的Ipilimumab）在体外并不能很好地阻断细胞表面的CTLA-4/B7的相互作用【图2D】，也不能有效地阻断CTLA-4介导的B7分子的转胞吞（Transendocytosis）作用【图2E】。与此不同的是，刘阳/郑盼教授联合实验室筛选出的另外一种抗CTLA-4的半人源化的抗体L3D10 （Blood. 2005 Feb 1;105(3):1114-20.和Blood. 2005 Nov 1;106(9):3127-33.），却能非常显著地阻断各种形式的CTLA-4/B7的体外相互作用【图2】。 此外，在human CTLA-4 knock-in的人源化小鼠和human CD34+ stem cells重组的NSG小鼠中，L3D10——而不是Ipilimumab——能够显著抑制human CTLA-4对脾 脏树突状细胞表面B7分子的转胞吞下调【图2F】，从而提供了在体内实验中的生理状态下Ipilimumab不能有效阻断CTLA-4/B7相互作用的证据。

       图2. 当B7分子被固定时，L3D10——而不是Ipilimumab——能够在体外和体内显著阻断CTLA-4/B7的相互作用。（摘自Cell Research (2018) doi:10.1038/s41422-018-0011-0）

       更重要的是，刘阳/郑盼教授联合实验室的研究指出，阻断CTLA-4/B7的相互作用，并没有贡献于抗CTLA-4抗体的抗肿瘤效果。这一论断来自多个方面的实验证据：

       1）在human CTLA-4全人源化（CTLA4h/h，即CTLA4的两个等位基因均来自human）的小鼠模型中，抗human CTLA-4的抗体L3D10能够有效阻断CTLA-4/B7的相互作用；而在human CTLA-4半人源化（CTLA4h/m，即CTLA4的两个等位基因一个来自human，一个来自mouse）的小鼠模型中，只能识别human CTLA-4的L3D10不能有效阻断CTLA-4/B7的相互作用。尽管如此，在CTLA-4全人源化和半人源化的小鼠模型中，L3D10和Ipilimumab都能有效的消除MC38肿瘤【图3A、图3B】和减缓B16肿瘤的生长。

       2）将半人源化的L3D10进行完全人源化后筛选得到的两株失去阻断CTLA-4/B7相互作用能力的HL12和HL32抗体【图3C】，并没有影响其抗肿瘤的作用，因为HL12和HL32展现出与Ipilimumab一样的抗肿瘤效果【图3D】。

       3）用B7分子的阻断性抗体1G10/GL1处理实验小鼠，在事先阻断B7功能的情况下，Ipilimumab仍能发挥有效的抗肿瘤作用，进一步说明其并不依赖于阻断抑制性的CTLA-4/B7信号通路【图3E】。

       4）三种常见的抗mouse CTLA-4抗体（4F10/9D9/9H10），它们阻断CTLA-4/B7相互作用的能力差别很大（如9D9和L3D10一样具强阻断能力，而9H10则不显示或者具备非常弱的阻断能力）。然而，文献报道它们都具备非常好的抗肿瘤作用。

       图3. 抗CTLA-4抗体治疗肿瘤的主要分子机制是通过清除肿瘤局部的Treg，而不是通过阻断CTLA-4/B7相互作用的抑制性信号通路。（摘自Cell Research (2018) doi:10.1038/s41422-018-0011-0）