在单克隆抗体发现过程中，通过抗体库的筛选，一旦得到一个能够和靶点特异性结合的优秀的候选分子，就需要通过一定的工程化技术来增强药理学和其他方面的功能。多种策略可以改善抗体药物的动力学功能，包括亲和力成熟、嵌合或人性化和Fc修饰。为了提高抗体的成药性和稳定性，需要提高抗体的稳定性和聚集性，以及降低免疫原性，其中一些策略也可以通过计算机工具来实现。

       嵌合或人源化降低免疫原性

       早期，鼠抗体进入人体后，会使人体免疫系统产生应答，及产生人抗鼠抗体(HAMA)反应，诱导超敏反应或鼠抗体的作用被抗鼠抗体中和。解决这个问题的方法是通过嵌合或人性化，使抗体更接近人类抗体。人-鼠嵌合抗体是将鼠抗体可变区基因片段连接到人抗体恒定区基因上。人性化抗体是将鼠抗体的DCR区移植到人抗体的相应部位，这样人源化程度可达90%以上。

       随着计算机辅助模拟技术的发展，人源化抗体技术进入了第二代，其策略包括：①部分DCR移植，即将抗体结合抗原所必须的部分CDR移植到人抗体法人框架上，获得免疫原性更小的人源化抗体；②表面重塑，即对鼠源CDR与FR表面残基进行镶嵌/重塑，使之类似于人抗体CDR的轮廓、人FR的形式；③特定决定区移植，即将抗体中与抗原密切作用的关键氨基酸形成的SDR移植到人抗体相应的位置。此外，为了保证抗体的亲和力，研究者还提出了CDR补偿、定位保留和模板替换的策略。

       尽管非人类抗体的人源化在今天仍然很普遍，但是转基因老鼠的出现，更重要的是，全人(合成)抗体库已经减少了对这些策略的需求。然而，任何治疗性的单抗都有免疫原性，无论其来源是什么，因此，在评估患者的风险-收益率时，应始终考虑这一问题。

       体外亲和力成熟

       对于治疗性抗体来说，抗体亲和力的提高有助于降低用量和毒副作用。抗体体外亲和力成熟策略来源于体内抗体成熟过程(见图1)。构建集中突变或特点突变的小容量抗体库，或将突变引入到原始抗体的可变区域，通常是CDRs区，通过表面展示技术筛选出高亲和力抗体。特别强调的是CDR H3在抗原识别和潜在构象变化方面的独特作用。同时，周围的FR区域也应该考虑在内。一般情况下，均可以得到10倍的亲和性改善。

       为了模拟获得性免疫系统，形成了一种具有人可变序列重排、细胞表面展示、弱结合分离以及重组AID介导的SHM体外哺乳动物系统。初步鉴定，低亲和力的单克隆抗体在体外SHM中产生了一种低pM亲和力。在SHM中，Ig基因插入和删除增强了体内和体外的亲和力成熟。

       图1 工程化技术增强抗体药理学和稳定性

       计算机工具也应用于亲和性的成熟。早期的计算机模拟集中于离子作用和单一突变体，以提高mAbs(如西妥昔单抗和贝伐单抗)的亲和力10-100倍。另一种基于CDR3的随机化和合理性设计的组合方法，将低μM scFv亲和力提高了450倍。

       并非所有的治疗应用都渴望获得最佳疗效的高亲和力。在癌症的背景下，高亲和力binder受“结合位点屏障”作用，只能在肿瘤的边缘部位进行定位。在另一个例子中，抗转铁蛋白受体mAbs只能在其亲和力适中的情况下，在血液中传递有效载荷通过血脑屏障(BBB)。在这两种情况下，具有较低的亲和力使mAb仍然能够与目标结合在一起，但随后可以被释放，以增强肿瘤或BBB的穿透能力。

       Fc修饰增强效应功能和半衰期

       对Fc区域的修饰可以对特定抗体的药理作用产生深远的影响。重要的是，针对肿瘤的治疗性mAbs的活动主要由激活和抑制Fcγ受体(FcγR)、FcγRIII或FcγRIIB的参与主导。这表明，细胞毒性的mAbs将会优先与FcγRIII结合，同时减少FcγRIIB的参与，有更大的临床疗效。在利妥西单抗中，只对少量的氨基酸进行替换，在体外和体内就显示出了增强的ADCC作用。另外，糖基化修饰的改变也可以增强FcR的相互作用。利用GlycoMAb技术，是mAbs Fc区域表达平分的非核心岩藻糖，抗CD20抗体GA101比利妥西单抗具有更强的ADCC作用、抗肿瘤功效和B细胞耗竭。该技术与POTELLIGENT技术相结合，用于治疗复发性或难治性成人T细胞白血病/淋巴瘤抗体药Mogamulizumab已经获批。

       图2 血液及核内体中IgG的Fc片段与新生儿受体FcRn的相互作用受pH影响

       Fc的存在还会导致血液循环时间增加。许多研究已经对Fc的修饰进行了研究，以延长抗体的半衰期。由于pH依赖FcRn的相互作用，诱变研究的重点是取代直接与FcRn结合的Fc氨基酸，以增加pH=6时亲和力，而不是pH=7.4。虽然对增强的循环时间的Fc修饰可能会影响Fc的效应功能，但研究表明，贝伐单抗和西妥昔单抗的不同AAs的突变导致了小鼠癌症模型中更有效的抗肿瘤活性，从而验证了增加治疗性抗体的半衰期的策略。自那以后，有大量的有利突变被报道。不幸的是，动物模型的结果并不总是与人类相关。然而，与FcRn的亲和性增加5-10倍，通常会导致半衰期增加2-4倍。

       图3 抗体ADCC和CDC效应原理

       提高稳定性和降低聚合性

       许多治疗性的mAbs在非生理条件下表达的是有限的热稳定性和胶体稳定性，使它们的制造和保质期变得令人沮丧。因此，一些工程策略旨在提高mAb的物理特性，以提高其整体功效或生产能力。为了减少聚合而进行的研究主要集中在改变抗体框架、抗原结合环和结合域结合界面。更具体地说，稳定策略包括：(a)剂型的调整;(b)特定点突变(框架和/或CDR);(c)在CH2-CH3域中添加额外的域内二硫键;(d)改变Fab区二硫键结构;(e)和/或带电的融合标签。同样，在计算机算法的发展过程中，利用合理的设计和体外选择方法，可以抵消聚合，并预测高黏度、化学降解和快速血浆清除。

       图4 抗体的非天然聚合过程

       以上的工程策略主要集中在改进“纯”的mAbs上。除此之外，还有一些其他的生物共轭策略，以提高整体的mAb治疗指数，每一个都有其自身的优点和缺点。例如，批准的单抗与小分子药物的偶联或放射性同位素的结合，目的是将载体的力量集中到目标细胞/组织。另一种选择是，双特异性抗体和CAR-T细胞疗法，旨在将T细胞重新定位为肿瘤治疗癌症，而纳米技术则利用抗体作为靶向配体或作为诊断和/或药物传递的有效载荷。

       参考文献：Kennedy P J,Oliveira C, Granja P L, et al. Monoclonal antibodies: technologies for early discovery and engineering[J]. Critical reviews in biotechnology, 2018, 38(3):394-408.

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