登革热是一种通过蚊子传播的病毒性感染，类似于流感，可发展为致死性并发症，即重症登革热。登革热发病率快速上升，多发于热带和亚热带地区，全球约半数人处于登革热风险之中；在部分国家，重症登革热是儿童严重疾病和死亡的主要原因。目前没有针对性的登革热治疗手段，及早诊断和有效医护可以将死亡率控制在1%以下。

       登革热疫苗研发历经数十年，尝试了多种技术；赛诺菲巴斯德（Sanofi Pasteur）历经20多年成功研制出四价减毒活疫苗Dengvaxia，成为全球第一个上市的登革热疫苗，但上市后却引来纷争不断。本文对登革热疫苗的开发历程和现状做一总结。

       一、什么是登革热

       登革热，俗称"断骨热（breakbone fever）"，是由登革病毒引起的急性传染病，主要通过埃及伊蚊或白纹伊蚊叮咬传播。登革病毒属黄病毒科黄病毒属，共有4种血清型（DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4），4种血清型均可感染人，其中DENV-2型的重症率及病死率均高于其他型。各血清型病毒之间不会产生免疫作用，所以可以被不同的血清型登革病毒重复感染。登革病毒感染后，人体可对同种血清型病毒产生持久免疫力，但对异型病毒感染不能形成有效保护，若再次感染异型或多个不同血清型病毒，发展为重症登革热的风险就会大幅上升。

       登革热临床表现为高热、头痛、肌肉、骨关节剧烈酸痛、皮疹、出血倾向、淋巴结肿大、白细胞计数减少、血小板减少等。根据病情严重程度，可将登革热分为普通登革热和重症登革热（包括登革出血热和登革休克综合征）两种临床类型。

       目前尚无特效的抗病毒治疗药物，主要采取支持性及对症性治疗措施。治疗原则是早发现、早诊断、早治疗、早防蚊隔离。重症病例的早期识别和及时救治是降低病死率的关键。常见的对症治疗措施包括退热、补液和镇静止痛；针对重症登革热患者，还应考虑采取抗休克疗法、输血和保护心脏、大脑和肝肾功能等措施，以及预防并及时治疗各种并发症。住院对症治疗可以大幅降低死亡率，从最高的20%减少到低于1%。

       登革热威胁着全球约一半人口，流行于全球热带及亚热带地区，尤其是在东南亚、太平洋岛屿和加勒比海等100多个国家和地区。WHO已经在全球登革热流行国家和地区建立起报告体系，2015年收到报告登革热病例为320万例。但是，登革热往往由于轻度非特异性至危及生命并发症的大范围临床症状而误诊，同时监控系统的局限性也是导致登革热病例报道不足的原因。WHO在2017年公布的数字是，每年全球登革热感染为3.9亿例，其中9600万例有临床表现，另外每年约有2万人因此死亡。

       二、WHO在努力

       面对登革热在全球的肆虐，WHO一方面制定防控战略，另一方面也在积极指导各个国家进行登革热疫苗开发与接种工作。

       制定防控战略

       面对如此严峻的流行趋势， WHO于2012年发布《2012-2020登革热防控全球战略》，目标是在2020年相比2010年，死亡率降低50%，发病率降低25%。

       同时，WHO提出从以下5个方面着手：

       第一，加强诊疗管理；

       第二，全面疫情监测和应对；

       第三，传染传播媒介持续控制；

       第四，未来疫苗接种实施；

       第五，执行和操作层面基础研究。

       资助启动疫苗研究

       1976年1月，WHO东南亚区域医学研究咨询委员会（SEA/ACMR）第一次会议在印度新德里召开。在那次会议上，与会人员达成共识向WHO东南亚区域主任建议将重症登革热研究纳入优先事项。

       1976年8月，SEA/ACMR第二次会议回顾了东南亚地区登革热疫情的传播情况，同时评估了对登革热流行病学、病毒学、发病机理和临床管理的最新认识。

       1977年2月，SEA/ACMR重症登革热研究小组会议上提出两项工作重点：一是疫苗研究，二是控制埃及伊蚊。疫苗研究的第一个计划就是东南亚和西太平洋地区病毒学家前往夏威夷大学热带医学和临床微生物学学院接受疫苗研发相关培训。培训完成后，回到各自国家参与登革热疫苗开发项目。

       1978年，WHO指定泰国Mahidol大学附属Ramathibodi医院下属的医学院病理系承担疫苗研发任务。

       1980年，WHO开始拨付资金。Mahidol大学设立三个实验室并添置设备和制定操作规程，又招募了病毒学家前往夏威夷大学开始疫苗前期研发。

       1987年，研究团队整体转移到Mahidol大学疫苗开发中心。

       1990年，实验动物房和疫苗中试车间投入运营。

       1993年1月，Mahidol大学与赛诺菲巴斯德（Sanofi Pasteur）签署协议合作开发登革热四价减毒活疫苗，由后者进行工业化开发。双方共同开展临床试验。

       2004年，由于DENV-3病毒株存在反应原性且无法解决，赛诺菲巴斯德决定放弃。

       从1980年到1995年的十五年间，WHO累积资助250万美元，并且从1983年到1994年每年召开专门会议商讨疫苗开发进展。

       虽然经历了失败，但WHO在病毒株筛选、药学开发和临床试验方面积累了大量经验，为今后指导疫苗开发，制定相关指导原则奠定重要基础。此外，赛诺菲巴斯德在这个过程中对四种血清型登革病毒有了深刻的了解，而且与Mahidol大学合作过程也为后来在泰国开展临床试验积累了丰富的经验。而且，在此期间挑选出来的病毒株DENV-2（16681）PDK 53后来被用作骨架做进一步研究，成为Takeda项目的重要基础。

       指导疫苗开发

       为了指导各个国家药品监管机构和各个药厂在疫苗审评审批环节的工作，WHO早在2006年和2011年发布和更新了关于第一代登革热四价疫苗研发的指导原则，涵盖了第一代登革热减毒活疫苗生产、质量控制、临床前开发和临床评价内容，并提出该指导原则会随着第二代疫苗新技术的出现而不断更新。指导原则指出，登革热疫苗的安全性和有效性的评价工作应当特别细致，尤其是试验受试者在接种疫苗后长期随访、疫苗上市后研究以及监控疫苗对登革热流行病学和疾病负担影响的监测体系。

       在《2012-2020登革热防控全球战略》中，WHO预计在2014年到2016年之间会有登革热疫苗批准上市。

       指导疫苗接种

       WHO除了指导工业界和各国药品监管机构开发和审评审批相关疫苗产品，还为各国卫生防疫机构指导制定相关接种政策和实施方案。

       WHO指出，登革热流行国家和地区在期待科研人员努力开发疫苗产品之时，应当确保建立起强有力的药品监管和监测体制，同时立刻着手准备疫苗接种规划，包括疫苗产品信息，以及疫苗接种策略、疫苗对疾病负担的影响和性价比，还有疫苗接种实施过程中的诸多问题，如纳入全民免疫计划、疫苗储存运输、财政保障等。

       三、疫苗开发之路

       由于登革病毒有四种血清型，感染其中一种血清型之后并不会对其他三种血清型产生免疫，且一旦再次感染，疾病严重性会显著上升，因此业内达成共识开发四价登革热疫苗。

       下面按不同技术介绍几种进入临床阶段的项目。

       1. 传统减毒活疫苗

       传统减毒活疫苗通过细胞培养多次传代获得。人们已经利用这种技术成功开发出天花疫苗和Sabin疫苗。针对登革病毒，夏威夷大学开发出通过原代狗肾细胞（PDK）进行多次传代的方法。每次病毒传代，在外源宿主细胞（PDK）中培养的病毒基因组中就有可能产生减毒点突变。在传代过程中，主要关注以下减毒标记筛选和评价病毒生物学性质：

       在一定温度条件下复制

       噬斑较小

       细胞病变效应

       小鼠神经毒性

       人单核细胞生长

       一般来说，需要经历10-50次传代才能获得候选疫苗。

       这种方式的优势在于持续的体液免疫反应和细胞免疫反应，从而对病毒结构蛋白和非结构蛋白都有广泛的抗原反应。不过在理论上也存在一定风险，即有可能转化为具有毒性的野生表型，特别是在四价病毒组合物中。此外这种四价疫苗中的不同血清型之间存在病毒或免疫干扰。

       泰国Mahidol大学II期失败

       Mahidol大学的四种血清型病毒株全部从东南亚重症登革热感染患者体内分离得到，在哺乳动物细胞上传代，然后通过胸内途径接种到安布因巨蚊（Toxorhynchites amboinensis）或埃及伊蚊上，消除非虫媒病毒，因为只有虫媒病毒可以在胸内给药后迁移到蚊子的唾液腺中。再将蚊子头部取下并磨碎，从而获得纯净病毒株。

       接下来，每隔5-10天，在32℃时，血清型1,2,4病毒在原代狗肾细胞（PDK）上传代，而血清型3病毒通过绿猴肾细胞（GMK）上传代，最后在胎猕猴肺细胞（FRhL）上培养减毒，从而获得适用于疫苗的病毒株，即：

       DENV-1（16007）PDK13（编号16007血清型1在原代狗肾细胞传代13代）

       DENV-2（16681）PDK53（编号16681血清型2在原代狗肾细胞传代53代）

       DENV-3（16562）GMK30 FRhL 3（编号16562血清型3在绿猴肾细胞传代30代后在胎猕猴肺细胞传代3代）

       DENV-4（1036）PDK48（编号1036血清型4在原代狗肾细胞传代48代）

       在一价、二价和三价疫苗的1期临床试验中，DENV-1（16007）PDK 13、DENV-2（16681）PDK 53和DENV-4（1036）PDK 48表现基本可以接受，其中又以DENV-2（16681）PDK 53表现最佳。但在一价试验中，DENV-3（16562）GMK 30 FRhL 3相比其他三种病毒株存在一定反应原性。另外在四价疫苗的II期试验中，即加入DENV-3（16562）GMK 30 FRhL 3后观察到干扰现象。后来，将DENV-3再进行筛选，获得DEN-3 GMK33 FRhL 2。赛诺菲巴斯德还找到美国疾控中心对DENV-3病毒株作进一步研究，发现该病毒株还分为两种，其一是减毒型，另一个依然是有毒性的野生型。在后续的临床试验中，还是观察到DENV-3病毒株的反应原性，不适合疫苗。为此，赛诺菲巴斯德选择放弃。

       葛兰素史克TDENV LAV搁置

       美国国防部下属研究机构Walter Reed Army Institute of Research（WRAIR）利用相同技术也获得了候选病毒株DENV-1 45AZ5 PDK-20、DENV-2 16803 PDK-50、DENV-3CH53489 PDK-20 和 DENV-4 341750 PDK-20。后来，GSK也加入到本项目研究中。

       在多项临床试验中，出现不同病毒株的免疫原性和反应原性难以平衡，如出现发热和病毒血症等，虽然重新调整了传代数，但效价在理论值和体内以及体外之间存在较大差异，加上疫苗生产过程十分复杂，因此双方产生分歧。葛兰素史克放弃该项目，而WRAIR准备将此作为补强剂另外打算。

       2. 重组亚单位疫苗

       默沙东开发的V180是一种灭活疫苗，只含有结构包膜蛋白的截短型。具体来说就是保留氨基末端80%包膜蛋白（胞外区），而去除C末端20%包膜蛋白（跨膜区），这样既可以胞外分泌，易于纯化，同时保留抗原，还能避免不同血清型之间相互干扰。由于灭活病毒自身难以激发免疫，灭活疫苗须配合佐剂使用从而激发免疫。V180须接种三剂，且每次均间隔一段时间。

       临床试验从2012年正式启动，到2014年完成I期研究。2015年与美国国立卫生研究院过敏与感染研究所合作，用于曾经接种过减毒活疫苗TV003或TV005的受试者。未见后续报道。

       3. 灭活纯化疫苗

       灭活疫苗可以有效避免病毒干扰和转化为致病表型的风险，但是也存在灭活过程中病毒蛋白结构改变以及灭活病毒无法扩展的缺点。

       葛兰素史克的TDENV PIV是一种灭活疫苗，经纯化处理，即只含有灭活的登革热病毒。在临床前实验中，TDENV PIV配合佐剂接种两剂，间隔4周。临床试验从2012年正式启动，分别在美国和波多黎各进行，一个低流行地区和一个高流行地区。另有一项1/2期试验配合特定佐剂AS03B采用不同接种周期。结果预计会在2018年陆续公布。

       本项目是美国国防部下属研究机构Walter Reed Army Institute of Research（WRAIR）与葛兰素史克的再度联手，此外还有巴西卫生部下属研究机构Fiocruz和Bio-Manguinhos的加入。

       4. 嵌合型减毒活疫苗

       通过基因工程技术，以黄病毒作为骨架，将其前膜蛋白和包膜蛋白替换成理想病毒株对应基因区段。如此一来，即获得减毒表型，又可以表达靶标抗原。相比传统减毒活疫苗的优势在于构建的精准性。嵌合型疫苗拥有标准化的减毒骨架序列，这消灭了传统疫苗存在的病毒株之间的基因重组的可能性。此外，还可以降低不同血清型之间病毒或免疫干扰的风险。

       美国国立卫生研究院（NIH）过敏与感染研究所（NIAID）TV003处于3期临床试验

       这是一种减毒活疫苗，采用重组技术将血清型4非结构基因和血清型2结构基因结合。该疫苗可以诱导抗体和细胞免疫应答，只需一剂就可以产生足够的免疫力。

       NIAID将TV003转让给多家机构，包括巴西Instituto Butantan、越南VaBiotech、印度Panacea Biotec、SerumInstitute of India 和 Indian Immunologicals、台湾Medigen Biotech，以及默沙东（代号V181）。临床试验从2011年正式启动。目前巴西Instituto Butantan在巴西进行大规模III期试验。泰国和孟加拉在进行II期试验。

       武田DENVax（TDV，TAK-003）处于3期临床试验

       这是一种减毒活疫苗，采用重组技术将血清型2非结构基因与血清型1，3，4结构基因结合。其中，用作骨架的病毒株DENV-2最初来自于Mahidol开发的DENV-2（16681）PDK 53。该疫苗须接种两剂，间隔3个月。

       临床试验从2010年正式启动。2013年5月，武田以2.15亿美元收购Inviragen公司，从而获得DENVax，当时已经处于2期。2017年11月公布2期结果显示2-17岁青少年儿童接种后免疫效果持续18个月，无论之前是否感染登革热。目前正在进行3期试验，预计在2018年底完成。

       赛诺菲巴斯德CYD-TDV于2015年12月全球首次批准

       同DENVax和TV003一样，CYD-TDV也是减毒活疫苗，但后者采用重组技术将黄热病毒非结构基因与全部四种血清型登革病毒结构基因结合。该疫苗接种三剂，每次间隔6个月，时间跨度为1年。

       临床试验从2009年正式启动，两项平行3期随机试验于2014年底完成疗效监测期并于2015年初陆续在各国提交上市申请，最终于2015年12月在墨西哥、菲律宾和巴西获得批准。该疫苗商品名为Dengvaxia。