外泌体是一种小型胞外囊泡（sEVs），来自于多泡体（MVBs），通过运输蛋白质、mRNA和miRNA介导细胞间的通信。然而，哪类蛋白质被归为sEVs的分子机制还不是完全清楚。在这里，作者报道了泛素样3（UBL3）膜锚定的Ub折叠蛋白MUB作为翻译后修饰因子PTM调节蛋白向胞外囊泡转化。作者发现UBL3的修饰对于将UBL3归类到MVBs是不可缺少的。同时作者还发现从UBL3缺失型小鼠样本中纯化的sEVs总蛋白，与野生型小鼠相比减少60%，并从蛋白质组学分析结果中发现了1241个与UBL3互作蛋白，包括Ras。作者展示了UBL3改变Ras基因和致癌基因RasG12V突变体，UBL3的表达促进RasG12V到sEVs的转变。综上所述，结果表明PTM被UBL3取代并影响蛋白到sEVs的归类转化。

       研究内容及结果

       1. UBL3作为转录后调控因子的分析

       目前对于UBL3作为PTM转录后调节因子的作用还不清楚，为了明确这一调控机制，作者在MDA-MB-231乳腺癌细胞中过表达带Flag的Flag-UBL3（16kDa），并通过免疫共沉淀纯化UBL3蛋白。有趣的是，在过表达Flag-UBL3细胞中，UBL3条带出现弥散现象，并在样品装入SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳之前添加2-mercaptoethano（βME+）后信号消失。为了验证UBL3修饰确实发生在体内，作者建立了UBL3敲除小鼠，并在脑组织（此组织UBL3高表达）中分析PTM，发现PTM表达下降。作者同时构建了UBL3C113/114突变，检测发现不仅在MDA-MB-231细胞中，在每一个所检测的细胞中UBL3均不表达。但在UBL3C113A和UBL3C114A突变体中，UBL3修饰表达虽降低但仍能检测到其表达。

       2. UBL3向MVBs和sEVs转化过程中UBL3的修饰不可缺少

       作者通过免疫荧光检测UBL3的亚细胞定位，发现细胞质中UBL3修饰程度下降。接着构建UBL3加EGFP荧光，并与MVBs的标记物CD63进行融合分析，进一步验证UBL3在MVBs多泡体中富集。为进一步证明MVBs多泡体中UBL3修饰与定位，作者检测了UBL3C113A、UBL3C114A、UBL3C113/114A及UBL3△1与CD63融合分析，与野生型UBL3检测不同，野生型的未见到与CD63融合。为了了解UBL3在多泡体及膜中的定位，作者又进一步安排了免疫电镜检测。将加了Flag标签的UBL3质粒转染进MDA-MB-231细胞后，UBL3在MVBs及质膜中表达清晰，在线粒体及核膜中未检测到表达。其中UBL3△1主要定位于质膜，不在MVBs中。这些结果显示UBL3修饰在MVBs形成中是必须的。

       3. UBL3敲除小鼠中外泌体中总蛋白下降，UBL3修饰影响蛋白向胞外分泌

       作者在前期的研究中发现，MVBs更多的倾向于分泌成胞外囊泡EVs，将MDA-MB-231细胞分泌上清分别在2000×g（2K）离心力、10000×g（10K）离心力及100000×g（100K）离心力下离心，发现在100k离心力下UBL3富集程度最高。通过对构建的UBL3敲除小鼠与正常小鼠进行蛋白质组学定量分析，发现UBL3敲除小鼠中外泌体总蛋白含量比野生型降低60%。

       为更好的了解UBL3修饰后其生理功能，作者进行了全面的蛋白质组学研究分析，UBL3互作蛋白依赖于两个C端半胱氨酸残基的方式。同时作者发现在与UBL3互作的蛋白中至少有22个与疾病相关的分子，包括与肿瘤形成、代谢、转移等相关，例如HRAS、KRAS、TGFBR1、TGFBR2、RB1、ITGA6、ITGB4、mTOR、TSC2及APLP2。同时发现与免疫应答相关的分子mTOR、RPTOR及TSC2，Notch信号分子NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3等。为检测UBL3是否经外泌体形式引起受体细胞中Ras信号激活，作者将从经RasG12V转染的MDA-MB-231细胞上清中提取的经PKH67包被的外泌体与细胞共孵育，检测磷酸化ERK的表达情况，结果发现，相比于从UBL3C113/114A及RasG12V共转染后提取外泌体孵育组，磷酸化的ERK（pERK）在经野生型UBL3及RasG12V共转染后外泌体孵育组pERK表达明显上调。UBL3修饰诱导了RasG12V到外泌体sEVs转化过程中Ras信号的激活，UBL3作为一个类似于标签的作用向sEVs传递蛋白。

       文章小结

       1.通过研究数据表明UBL3通过C端半胱氨酸残基二硫键结合靶蛋白，尽管UBL3有泛激素类似的区域，但UBL3修饰与传统泛激素作用不同。

       2. 作者证明了UBL3修饰在UBL3向MVBs及sEVs转化过程中起重要作用。检测到1241个与UBL3C端半胱氨酸残基互作蛋白，其中29%被注释为胞外泌体，同时发现UBL3敲除小鼠中外泌体蛋白总量降低60%，显示UBL3极大可能参与过半的外泌体蛋白归类过程。UBL3与特定蛋白的结合是短暂的，只有UBL3修饰后蛋白在细胞裂解过程中稳定存在。

       3. 外泌体sEVs中的特异性蛋白在肿瘤的生长发生及转移过程中其中重要的作用。本文中作者通过蛋白质组学确定了1241个依赖于两个C端半胱氨酸残基结合与UBL3互作的蛋白，其中包括了至少22个疾病相关分子，影响pERK磷酸化蛋白的表达。因此，抑制UBL3修饰可能成为与Sev相关疾病的治疗靶点，具有潜在的影响。