众所周知,药物进入机体后,能够在各种酶的催化下发生代谢转变,生成结构相近的代谢产物。虽然结构与母药类似,但是代谢产物绝对算是项目研发中出现的新化学成分。利用动物和体外手段对候选化合物进行毒理研究,通常更关注母药特性,而非代谢产物。并且动物种属与人体可能存在差异,不能简单假设所产生的代谢产物就与人体就相同,当某种代谢产物在人体中的暴露量与动物种属不成比例(disproportional)时,就存在安全性风险。鉴于此,代谢产物安全性评价(MIST,Metabolites in Safety Testing)的概念被提出。

       自上世纪90年代初,液质联用技术(LC-MS)取得了突破性发展,革新了药物代谢领域的技术手段,在诸如血浆等复杂基质中代谢产物的鉴定也变得相对容易。再加上放射性标记的ADME(吸收、分布、代谢和排泄)研究能够对血浆、尿液和粪便生成定量代谢产物谱图,使得代谢产物研究成为药物研发的重要组成部分。

       虽然一般药物对开发团队来说都很清楚代谢产物可能有药效活性或者毒性作用,需要予以考察,但是具体到项目,却面临以下问题:

       1.哪些代谢产物需要纳入安全评价范围?

       2.是否存在代谢物暴露量的阈值,来决定进一步研究的必要性?

       3.代谢产物的化学结构是否有必要获得?

       这些都需要有相关可遵循的法规或指导原则。

       MIST指导原则的变迁

       2002年,饱受人体代谢产物安全性困扰的工业界率先“发难”,一群来自不同公司和组织的科学家共同发表了药物代谢产物风险评估的建议书(参考文章2),文章提出在人体血浆中暴露量占比超过药物相关物质总量25%的代谢产物,必须在临床前毒理种属研究中得到覆盖,这是首次关于MIST的阐述。

       2008年,FDA终于发布了MIST的指导原则,将代谢物的阈值调整为人体血浆中药物原型的10%。

       2010年在综合了更广泛的意见后,ICH发布了指导意见,提出在人体血浆中暴露量占比超过药物相关物质总量10%的代谢产物,在开展大规模临床试验前,有必要对其进行非临床安全性研究(ICH M3(R2)。FDA随后跟进,在2016年修改指导原则与ICH看齐。

       图片整理自参考文章

       这些指导原则在药物安全性研究方面的促进作用毋庸置疑,但更重要的是它们提供了一个框架,让药物研发对代谢产物的研究有据可依。从临床前到临床,每个阶段所要解决的药物代谢问题不尽相同,可能因策略及靶点而不同。如肿瘤晚期、耐药HIV(艾滋病病毒)、先天性酶缺乏症等严重疾病的药物开发,对代谢产物安全性研究有相应简化措施。对常规项目,代谢产物典型策略可以分为三个阶段来描述:

       第一阶段 (Pre-IND)

       在此阶段,药物代谢研究主要针对体外(in vitro)和实验动物(in vivo),如肝微粒体、肝细胞、肝S9,重组酶或者血浆等。利用这些体外模型来孵育代谢产物,结合保留时间和质谱裂解规律来比较不同种属和人类的代谢产物定性/定量的差异,据此选择合适的种属开展毒理研究。或是研究动物给药后的体内代谢产物,和体外研究相辅相成。动物的体内结果并不能直接转化为对临床的准确预测,而是通过分析动物的主要代谢产物,判断代谢物谱是否能够覆盖人体结果,这对临床的安全性研究至关重要。

       第二阶段 (临床I期)

       临床I期多剂量递增试验(MAD)的稳态血浆样本可以用于人体代谢产物研究,这通常也是首次得到药物的人体代谢产物数据。LC-MS灵敏度虽然可以满足微量代谢产物的分析,但是合成代谢产物标准品工作量过大,可以根据紫外吸收数据计算代谢产物与母药的相对丰度。

       对于指导原则中代谢产物超过药物相关物质总量的10%,如何判断?如果将母药和所有代谢产物进行定量加和,需要大量合成标准品,显然不现实。总体来讲在这个阶段,还不需要准确定量,只要对比NOAEL(无明显损害作用剂量)下毒理种属的代谢产物和临床药效剂量下血浆代谢产物的结果,判断是否存在临床前未覆盖的代谢产物即可。常用方法有两种,一种是用Hamilton Pooling法计算代谢产物的“暴露量倍数”;另一种是依靠同位素标记试验,根据啮齿类同位素标记的物质平衡结果,对比大鼠的同位素标记代谢产物浓度得到因子,进而换算人体代谢产物的浓度。

       确定了临床前代谢产物的覆盖情况,就可以决定是否需要合成代谢物,是否需要开展专门的体内和毒理研究。但是很多研究团队选择把这部分工作往后放一放,在完成人体同位素ADME研究后再做决定,更有将针对代谢产物的研究放在临床概念验证(PoC)之后的,这也算是避免由于PoC失败做太多“无用功”。

代谢产物安全性评价(MIST)的“十年之痒”

       图片源自FDA网站

       第三阶段 (临床II期后,临床III期前)

       因为对主要代谢产物的研究必须在扩大临床前完成,所以在这个阶段所有必要的代谢物研究都应该结束了。包括代谢物定量、利用高分辨质谱确定未知代谢产物、人体同位素标记ADME研究(还可以用于确定哪些代谢物需要DDI评估)以获得所有代谢物谱图等。

       对MIST的一些思考

       从2008年FDA发布MIST指导原则至今已经十余年了,这十年间,对代谢产物和代谢安全性的重视逐渐深入人心,制药工业已经适应了MIST指南的要求,大量案例也为研发团队的代谢物研究计划提供了很好的借鉴。但是也遇到了不少的问题,首先,很少有项目真的开展过对代谢物的毒理研究,也很难找到循环代谢物直接引起安全问题的案例。很多情况下,明明安全问题已经指向代谢物,但最终又拿不出十足的证据。一方面这可能是由于代谢物和母药的性质很难区分,另一方面,对于一些活性中间代谢物,常规分析方法有时检测不到,造成很大难度。药物依帕列净 (Empagliflozin) 给予大鼠后,观察到明显的由代谢物介导的毒性,但未发现活性代谢物和下游代谢物。

       其次,反应性代谢物或下游产物(如谷胱甘肽或半胱氨酸结合物的代谢物)由于其分子量和亲水性高,通常通过胆汁和/或尿液迅速排泄,因此很难根据MIST的要求比较不同种属间反应性代谢物的暴露量差异。另外,在一些特定项目中测定靶组织中代谢物可能更为重要,却难以在人体开展。换句话说,随着技术的发展,对代谢产物的研究要做到何种程度?MIST所做的一切是否真的影响了药物安全性评价,这些都是未来我们需要去思考和解决的。

       指导原则只是提供了一个方向,对每个项目一定要case by case的去针对性设计研究方案,除了常规毒性,还应关注代谢物潜在的DDI发生。吉非罗齐 (Gemfibrozil)的葡萄糖醛酸化代谢物对西立伐他汀(cerivastatin)的代谢清除抑制(主要由CYP2C8和OATP1B1介导)导致了严重的后果。此外还有丁苯丙酮的代谢物对CYP2D6表达水平的影响,以及去甲基地尔硫卓对CYP3A4的抑制作用等。FDA和EMA的指导原则分别建议,当代谢物的体内水平达到母药的25%(FDA, 2012),或暴露量超过药物总暴露量的10%时(EMA, 2012),需要对代谢产物的CYP抑制和转运体抑制开展研究。FDA在2017年新的相关指导原则征求意见稿中进一步要求,对警示性化学结构(官能团),需要开展TDI(时间依赖性抑制)研究;对极性小于母药且暴露量超过母药25%的代谢产物,以及极性大于母药且暴露量高于母药的代谢产物,需要开展代谢物体外DDI研究。

       总之,MIST指导原则的提出不仅仅是DMPK科学家的研究参考,很大程度上也让药化、药理等科学家对代谢产物的安全性问题给予足够的重视,只有这样,新药的安全评价才会更加彻底,这也是MIST对药物研发最大的贡献。

       参考文章:

       [1] A Decade in the MIST: Learnings from Investigations of Drug Metabolites in Drug Development under the “Metabolites in Safety Testing” Regulatory Guidance. DOI: https://doi.org/10.1124/dmd.117.079848

       [2] Drug Metabolites in Safety Testing. DOI:10.1006/taap.2002.9440

       [3] Metabolites in safety testing. https://doi.org/10.4155/bio.09.98

       [4] FDA-Safety Testing of Drug Metabolites Guidance for Industry.

       [5] Guidance for Industry M3(R2) Nonclinical Safety Studies for the Conduct of Human Clinical Trials and Marketing Authorization for Pharmaceuticals.

       [6] Metabolites in Safety Testing: “MIST” for the Clinical Pharmacologist. doi:10.1038/clpt.2009.283

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